中國網(wǎng)/中國發(fā)展門戶網(wǎng)訊 工程細胞是綠色生物制造的“芯片”，在醫(yī)藥、化學(xué)品、材料、燃料等各類物質(zhì)的生物加工過程中充當(dāng)核心執(zhí)行者角色。目前，工程細胞的構(gòu)建往往依托設(shè)計—構(gòu)建—測試—學(xué)習(xí)（DBTL）循環(huán)策略，首先基于先驗知識和計算模型設(shè)計生物合成路徑，利用基因合成、組裝和編輯等技術(shù)進行工程細胞的構(gòu)建，進而對所構(gòu)建工程細胞進行測試，如基因型測試，以及包括細胞生長、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量在內(nèi)的表型測試，最后對測試結(jié)果進行綜合評估分析，用于進一步優(yōu)化設(shè)計，提高工程細胞工作效率。由于生命系統(tǒng)的復(fù)雜性，人們對代謝網(wǎng)絡(luò)和多層次調(diào)控機制認(rèn)知有限，往往需要構(gòu)建海量基因型進行大規(guī)模表型測試，才能獲得性能優(yōu)越的工程細胞底盤。因此，在DBTL循環(huán)中，工程細胞的高通量表型測試是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。

儀器設(shè)備是實現(xiàn)工程細胞高通量表型測試的基礎(chǔ)?？v觀工程細胞表型測試技術(shù)與裝備發(fā)展歷程，經(jīng)歷了平板、微孔板、自動化工作站和微流控4個階段。19世紀(jì)80年代，為了解決試管或燒瓶中單克隆難以觀察和操作的問題，德國微生物學(xué)家Julius Richard Petri發(fā)明了Petri平板培養(yǎng)皿，開啟了平板測試時代，這種用于單克隆分離培養(yǎng)的平板技術(shù)沿用至今。隨著測試通量需求的提高，20世紀(jì)50年代，德國微生物學(xué)家Gyula Takatsy發(fā)明了微孔板測試方法，集成單克隆培養(yǎng)與檢測，通量一般為103/天—104/天。由于微孔板操作耗時耗力，20世紀(jì)80年代，自動化工作站時代到來，并在后期逐漸形成集成克隆挑取、孔板培養(yǎng)、檢測、篩選自動化操作模塊于一體的集成平臺，每天實現(xiàn)104—105樣品高通量測試。20世紀(jì)90年代，Manz等首次提到微流控這一詞匯，定義為一種在微納米尺度空間中精確控制和操縱微納米流體的科學(xué)技術(shù)。21世紀(jì)初，微流控技術(shù)迎來迅猛發(fā)展，由于樣品操作體積小、檢測參數(shù)多樣（如熒光、散射光、吸光度、拉曼）、檢測通量高（每天測試樣品最高達到108—109）、成本低（試劑消耗比微孔板降低可達106倍）等巨大優(yōu)勢，微流控裝備成為工程細胞高通量表型測試研究熱點。面向合成生物學(xué)單細胞分析與高通量篩選等表型測試需求，近年來發(fā)展了非培養(yǎng)類型的單細胞測試、培養(yǎng)類型的液滴微流控測試與微腔室測試技術(shù)與裝備，為合成生物學(xué)的發(fā)展提供了重要的裝備支撐?？偟膩碚f，微流控技術(shù)的應(yīng)用，代表了工程細胞表型測試技術(shù)與裝備高通量、自動化、微型化、集成化、多參數(shù)的發(fā)展趨勢。本文將重點闡述基于微流控技術(shù)的非培養(yǎng)類型與培養(yǎng)類型工程細胞高通量表型測試技術(shù)與裝備研究進展，并展望其發(fā)展方向，為面向綠色生物制造的工程細胞表型測試提供借鑒。

單細胞高通量表型測試技術(shù)與裝備

單細胞表型測試技術(shù)是指基于單細胞自身特性如光學(xué)性質(zhì)、胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、形狀特征、毒性耐受、電學(xué)性質(zhì)等的檢測與分選技術(shù)。通過散射光與熒光、質(zhì)譜信號、拉曼光譜、顯微成像、磁信號等技術(shù)識別目標(biāo)細胞信息后，利用電場、磁場、光場、聲場、流體力場、重力場等方法驅(qū)動細胞向收集處運動，最終分選出目標(biāo)單細胞。下文對4類典型的單細胞表型測試技術(shù)與裝備進行總結(jié)。

熒光激活細胞分選技術(shù)與裝備

熒光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）是對熒光標(biāo)記的單細胞進行高速、多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)（圖1a），由控制細胞流動的流體系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、捕獲發(fā)射熒光和散射信號的電子系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。其原理是利用激光作為光源照射單細胞產(chǎn)生散射光和熒光信號，并將這些光學(xué)信號通過檢測器讀取、轉(zhuǎn)換為電子信號輸出，從而對單個細胞進行快速分析和篩選。

FACS技術(shù)用于熒光標(biāo)記的單細胞高通量測試，每天測試通量可達到108以上。近年來，基于熒光探針、細胞表面展示、生物傳感器等熒光標(biāo)記技術(shù)，F(xiàn)ACS在蛋白質(zhì)工程和工業(yè)菌株育種領(lǐng)域取得顯著進展，例如纖維素酶等定向進化，高產(chǎn)L-半胱氨酸大腸桿菌、高產(chǎn)L-賴氨酸谷氨酸棒狀桿菌等典型工業(yè)菌株的高通量選育。然而，F(xiàn)ACS單細胞表型測試技術(shù)受限于熒光標(biāo)簽的開發(fā)，以及胞內(nèi)與胞膜物質(zhì)的測試，同時流式細胞儀細胞分選前的高壓充電過程和分選過程中的高速噴射過程均對細胞產(chǎn)生一定損傷，致使活力下降。為了避免這些問題，研究者開發(fā)了雙乳化水包油包水液滴（W/O/W）、凝膠微球（gel-droplet）等技術(shù)，將單細胞包裹進水相液滴或水相微球中進行后續(xù)培養(yǎng)和FACS篩選。然而，這些方法由于步驟煩瑣、液滴易破損未得以廣泛應(yīng)用。

FACS技術(shù)裝備化方面，近年來，我國上海緯冉科技有限公司自主研發(fā)的SE420流式細胞分選儀實現(xiàn)了細胞樣本的全面分析與高通量分選，成都賽雷納醫(yī)療科技有限公司研發(fā)的小型Sparrow流式細胞儀以及深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的BriCyte E6流式細胞儀，目前一般用于單細胞的分析與檢測。在進口品牌方面，美國BD公司的FACS Calibur、FACS Melody、FACS Jazz、FACS Aria系列，美國Beckman Coulter公司的CytoFlex SRT、EPIC XL系列，日本On-chip Biotechnologies公司的On-chip Sort細胞分選儀均可進行多參數(shù)、高分辨率和靈敏度細胞分析與分選。可見我國FACS整體技術(shù)水平與國外仍有差距，在市場認(rèn)可度、儀器檢測精度、靈敏度、穩(wěn)定性及多參數(shù)檢測能力等方面有待提高。因此，需不斷加強基礎(chǔ)研究和技術(shù)創(chuàng)新，加大對關(guān)鍵零部件研發(fā)的投入，提高儀器的核心性能和自主可控性，加速技術(shù)轉(zhuǎn)化和人才培養(yǎng)，提升我國在流式細胞術(shù)領(lǐng)域的整體技術(shù)水平。

拉曼激活細胞分選技術(shù)與裝備

拉曼激活細胞分選（Raman activated cell sorting，RACS）是基于拉曼光譜檢測的單細胞分析和分選技術(shù)（圖1b）。拉曼光譜是一種散射光譜，每個散射峰都對應(yīng)于一種特定的分子鍵振動，因此可以識別單細胞內(nèi)部的全景信息，允許對單個細胞進行無損、無標(biāo)記的化學(xué)分析，并根據(jù)其分子組成進行物理分選，被視為一種快速、低成本的單細胞表型測試技術(shù)。根據(jù)分選時單細胞的運動狀態(tài)，RACS測試分為靜態(tài)細胞分析與捕獲、流動細胞分析與捕獲2種類型。前者是指在細胞靜止或相對靜止的狀態(tài)下，基于拉曼光譜信息分選出特定類型細胞至單管中，如拉曼彈射分選（Raman-activated cell ejection，RACE）、重力驅(qū)動拉曼光鑷液滴分選（Raman-activated gravity-driven encapsulation，RAGE）等技術(shù)，其優(yōu)勢為可以對接下游的單細胞培養(yǎng)、單細胞測序等研究，然而靜態(tài)單點捕獲通量過低。后者是指細胞懸浮在流動相中，在流動狀態(tài)下對單細胞進行拉曼光譜檢測，分選收集優(yōu)勢表型細胞，如拉曼微液滴分選（Raman-activated droplet sorting，RADS）、介電捕獲拉曼激活液滴分選（positive dielectrophoresis-based RADS，pDEP-RADS）等技術(shù)，單細胞在拉曼檢測后隨著流動相流動，通過油相剪切形成單細胞液滴進而分選至收集管，其優(yōu)勢為高通量，更適用于文庫中目標(biāo)表型細胞的測試。

RACS靜態(tài)單細胞測試技術(shù)主要應(yīng)用于單細胞組學(xué)研究，Song等利用該技術(shù)從海水樣品中分離出富含類胡蘿卜素單細胞，并在分離后對單細胞進行測序，發(fā)現(xiàn)了新型類胡蘿卜素合成基因；Su等通過對分離的單細胞全基因組擴增測序，實現(xiàn)了95%的基因組覆蓋度。而RACS流動單細胞測試技術(shù)主要應(yīng)用于單細胞底物代謝、產(chǎn)物合成和細胞的分析鑒定研究，通量每天可達到104以上。在細胞代謝測試中，通過使用13C、15N和2H等同位素標(biāo)記底物從而改變分子質(zhì)量，細胞攝入底物后，拉曼光譜發(fā)生變化，實現(xiàn)細胞代謝的分析研究。例如，Kumar等將13C標(biāo)記的糖類物質(zhì)等添加到底盤細胞培養(yǎng)基中，通過分析蛋白中13C拉曼光譜位移變化，揭示了細胞對碳源底物代謝的抑制機制。在胞內(nèi)產(chǎn)物合成測試中，拉曼光譜可以在無損且非標(biāo)記的狀態(tài)下同步檢測不同代謝產(chǎn)物，如色素、淀粉等物質(zhì)，為高產(chǎn)菌株的高通量篩選和定量分析提供新思路。此外，由于每種單細胞拉曼光譜具有特異性，可作為單細胞特有的“分子指紋圖”，進而反映出特定細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)成分及含量的多維信息。因此，RACS還被用于單細胞分析鑒定，如Yan等結(jié)合機器學(xué)習(xí)算法和拉曼光譜，在單細胞水平上鑒定出食源性病原體。

我國拉曼光譜單細胞表型測試裝備處于國際領(lǐng)跑地位。青島星賽生物科技有限公司率先開發(fā)了全球首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，該裝備能夠直接鑒定單細胞種類并測試代謝相關(guān)表型。吉林長光辰英科技有限公司開發(fā)了PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀，實現(xiàn)了單細胞識別與分離研究。

圖像激活細胞分選技術(shù)與裝備

圖像激活細胞分選（image activated cell sorting，IACS）是一種基于顯微成像的細胞分選技術(shù)（圖1c）。IACS技術(shù)的核心在于利用高分辨率顯微成像系統(tǒng)捕獲細胞的圖像，然后通過圖像分析軟件識別和分類細胞。這些圖像可以提供細胞的大小、形狀、紋理等信息，常用于特定細胞的高通量分離實驗。例如，Nitta等將三維成像技術(shù)和薄膜微閥流體驅(qū)動技術(shù)結(jié)合，獲取高質(zhì)量的細胞三維圖像，并通過薄膜閥驅(qū)動目標(biāo)細胞至收集管路中，以此完成細胞的圖像分析和分選。Akihiro等基于IACS技術(shù)，集成了高通量的光學(xué)顯微鏡、細胞聚焦、細胞排序和深度學(xué)習(xí)算法，開發(fā)了iIACS系統(tǒng)，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)采集、處理、智能決策和執(zhí)行的自動化操作。Zhao等將iIACS系統(tǒng)與人工智能（AI）圖像處理結(jié)合，進一步提高了基于圖像的單細胞分選通量。

基于IACS技術(shù)研發(fā)的裝備包括美國BD公司的ImageStream X MkII系統(tǒng)、美國Amnis Corporation 公司的ImageStream系統(tǒng)、美國Beckman Coulter 公司的CytoFLEX系列產(chǎn)品，實現(xiàn)了分選前的細胞圖像信息采集。我國青島星賽生物科技有限公司開發(fā)了EasySort AUTO系統(tǒng)，基于顯微成像與AI圖像分析技術(shù)，在該系統(tǒng)中，AI輔助目標(biāo)檢測模型實現(xiàn)了對目標(biāo)細胞的高精度識別，系統(tǒng)集成的光鑷模塊能夠?qū)⒓毎詣愚D(zhuǎn)移到收集管中。目前，我國在IACS領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，但由于起步較晚，還處于基礎(chǔ)技術(shù)的開發(fā)和優(yōu)化階段。因此，需要加強基礎(chǔ)研究、促進跨學(xué)科合作與國際合作交流，以逐步縮小我國IACS裝備與國際先進水平的差距。

磁激活細胞分選技術(shù)與裝備

磁激活細胞分選技術(shù) （magnetic activated cell sorting，MACS）是一種基于磁場和磁性標(biāo)記的細胞分離技術(shù)（圖1d），其核心在于使用超順磁性微珠標(biāo)記特異性抗體，這些抗體能夠識別并結(jié)合目標(biāo)細胞表面的特定抗原，一旦標(biāo)記完成，細胞混合物被引入磁場中，磁性微珠會被迅速吸附到磁場的一側(cè)，從而將標(biāo)記的細胞與未標(biāo)記的細胞分離，其通量為每天109樣品。MACS分離方式快速、高效，且對細胞的損傷小，適合于后續(xù)的細胞培養(yǎng)、分子分析，常用于動物細胞的分離。Munz等利用MACS技術(shù)成功分離小鼠脾細胞中的樹突狀細胞（DCs），并研究了其在免疫應(yīng)答中的作用。然而，該技術(shù)面臨特異性抗體標(biāo)記的問題，難以實現(xiàn)細胞的普適性測試。在裝備研究中，德國Miltenyi Biotec公司的AutoMACS、美國Thermo Fisher Scientific公司的Dynabeads，均成功實現(xiàn)了磁激活細胞分選設(shè)備商業(yè)化。此外，美國BD公司將MACS與FACS技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了FACSAria III產(chǎn)品，為用戶提供了更多的選擇?？梢妵鴥?nèi)MACS裝備產(chǎn)業(yè)化程度相對較低，缺乏具有國際競爭力的品牌，因此需要投入更多資源進行MACS技術(shù)的基礎(chǔ)研究，以提升我國MACS技術(shù)創(chuàng)新能力。

基于FACS、RACS、IACS、MACS技術(shù)原理開發(fā)的非培養(yǎng)類型單細胞高通量表型測試典型商業(yè)化裝備如表1所示。

微液滴高通量培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

液滴微流控技術(shù)（droplet-based microfluidics）是一種在微納米尺度上操控和處理微液滴的技術(shù)，通過在微通道內(nèi)操控互不相溶的多相流體，基于微流控芯片實現(xiàn)皮升（pL）至微升（μL）尺度液滴的單元操作，包括液滴的生成、注入、分裂、融合、信號檢測和分選等。與單細胞測試工具相比，液滴可以作為獨立的反應(yīng)單元培養(yǎng)單細胞，并進行后續(xù)胞內(nèi)、胞膜、胞外、無細胞體系相關(guān)物質(zhì)的高通量檢測與分選，具有體積小、單分散性好、無交叉污染等優(yōu)點。典型模式菌株如大腸桿菌、酵母菌等直徑在10微米以下，100皮升以內(nèi)的液滴即可滿足培養(yǎng)需求；而動物細胞、放線菌等直徑在10微米以上，需要將液滴體積增加至幾百皮升乃至納升級別才可以進行培養(yǎng)，絲狀真菌菌絲密集堅硬，在皮納升液滴中培養(yǎng)易造成液滴之間的融合，通常需要微升液滴體系才可長期培養(yǎng)。可見，不同表型測試場景下的液滴微反應(yīng)器尺度需求不同，下文將分別闡述皮納升液滴與微升級液滴測試技術(shù)與裝備。

皮納升液滴培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

皮納升液滴是指體積范圍在1皮升—100納升的液滴，一般以油相作為連續(xù)相，水相作為分散相，當(dāng)兩相流體經(jīng)過毛細管共軸聚焦、微流控芯片流動聚焦等結(jié)構(gòu)時，油相剪切水相形成均勻的單分散液滴。通過泊松分布理論，單細胞被包裹在液滴中進行生長代謝，隨后基于不同的分選技術(shù)，如熒光激活液滴分選（FADS）、吸光度激活液滴分選（AADS）、質(zhì)譜激活液滴分選（MADS）、成像激活液滴分選（IADS）實現(xiàn)目標(biāo)表型細胞的分選和收集。

FADS技術(shù)是目前使用最廣泛的皮納升液滴篩選技術(shù)（圖2a），最早于2009年被提出，經(jīng)過10余年的發(fā)展，技術(shù)不斷迭代升級，已經(jīng)形成較為成熟的商業(yè)化裝備。FADS技術(shù)由驅(qū)動系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電學(xué)系統(tǒng)、微流控芯片系統(tǒng)等組成，通過微泵驅(qū)動液滴運動，激光器激發(fā)液滴熒光后，光學(xué)系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)化為電學(xué)信號輸出；當(dāng)信號位于設(shè)定的閾值時，通過介電泳等方式將液滴分選至芯片收集通道。該技術(shù)中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于開發(fā)熒光探針，實現(xiàn)熒光信號與細胞表型的耦合。針對細胞表達的生物酶活性測試，開發(fā)了熒光基團修飾底物檢測體系；針對小分子代謝物，開發(fā)了酶聯(lián)熒光探針傳感器、全細胞類與擬熒光蛋白類生物傳感器，極大拓展了FADS技術(shù)在合成生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用。

由于FADS技術(shù)需要開發(fā)相應(yīng)的熒光檢測體系，在具體使用場景受到一定限制，近年來還發(fā)展了AADS、MADS、IADS等無標(biāo)簽檢測分選技術(shù)。AADS技術(shù)是基于吸收光譜法的微液滴檢測技術(shù)（圖2b），Gielen等通過在液滴檢測口兩側(cè)，芯片上內(nèi)置兩根光纖，分別連接光源和檢測器，液滴流過時引起光譜吸收變化輸出信號，根據(jù)光吸收變化對感興趣的目標(biāo)液滴進行分選。該裝置用于苯丙氨酸脫氫酶的定向進化，酶活性增加了2.7倍。然而，由于皮納升體積液滴反應(yīng)器檢測光程過短、檢出信號困難，AADS技術(shù)仍處于底層技術(shù)研究階段。MADS技術(shù)是將微流控芯片通過接口連接ESI電離噴霧質(zhì)譜（圖2c），在微流控芯片上完成液滴的分裂，一部分液滴通過接口進入質(zhì)譜進行破壞性檢測，另一部分液滴備份。當(dāng)質(zhì)譜輸出符合預(yù)期的信號時，基于介電泳將備份的液滴分選至芯片收集通道，該裝置用于含有體外表達轉(zhuǎn)氨酶的液滴篩選，實現(xiàn)了0.7個/秒的液滴篩選速率，準(zhǔn)確率為98%。IADS技術(shù)是一種基于液滴圖像識別、處理與分析的無標(biāo)記分選技術(shù)（圖2d），首先將細胞細胞懸浮液與試劑混合，進行單個細胞的封裝，在微環(huán)境中培養(yǎng)后通過顯微成像、熒光成像技術(shù)測試培養(yǎng)后的細胞群。Zang等通過對液滴成像，檢測液滴內(nèi)放線菌的生長量，實現(xiàn)了100個/秒目標(biāo)液滴的分選。

國內(nèi)外報道了眾多基于FADS技術(shù)的商業(yè)化皮升納液滴裝備。我國洛陽華清天木生物科技有限公司開發(fā)了商業(yè)化的高通量皮升級液滴單細胞分選系統(tǒng)DREM cell，實現(xiàn)了每天超百萬液滴的篩選通量。Ma等基于該設(shè)備將酯酶對映體選擇性提高了700倍以上。Yu等通過在目標(biāo)蛋白上添加四半胱氨酸，利用其與雙砷反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號，將分泌蛋白產(chǎn)量提高2.5倍以上。Li等通過構(gòu)建液滴生成、注入、分選流程，結(jié)合生物傳感器，有效提高了目標(biāo)小分子等代謝物的產(chǎn)量。DREMcell還用于微生物培養(yǎng)組學(xué)研究，如蜜蜂腸道菌群培養(yǎng)、作物致病拮抗菌株的資源挖掘。英國Sphere Fluidics公司研制了納升級Cyto-Mine設(shè)備，液滴操作體積為0.3納升，是一款單細胞包裹、檢測、分選與克隆驗證集成于單一平臺的單細胞分析篩選儀器，常用于快速檢測單個細胞的外泌分子（如IgG、抗原）等，然后根據(jù)液滴熒光信號強度選擇特定的單細胞。此外，浙江達普生物技術(shù)有限公司的CytosparkTM MSP皮升級液滴系統(tǒng)、深圳華大基因股份有限公司MGIDS-1000P多功能液滴分選一體機、浙江墨卓生物科技有限公司的MobiNova-S1單細胞液滴分選儀、大連華微科技有限公司的HW-SeaBreeze X等均實現(xiàn)了皮納升液滴分選技術(shù)與裝備開發(fā)。上海濤烜科學(xué)儀器有限公司基于IADS技術(shù)研發(fā)了Hypercell高通量單細胞分選平臺，每天可測試105—106產(chǎn)生分泌物的目標(biāo)單細胞。

微升級液滴培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

微升級液滴培養(yǎng)技術(shù)指的是基于微升級別體積的油包水液滴的單細胞培養(yǎng)和分選技術(shù)，每天可以完成104—105個樣本的測試。在培養(yǎng)方面，微升級液滴按序收集于透氣性管路中，管壁良好的氣體交換性能為細胞培養(yǎng)提供了硬件基礎(chǔ)。同時由于微升液滴比皮納升液滴體積更大，因此能夠支持更長時間、更多種類（放線菌、霉菌等大型細胞）的微生物培養(yǎng)，微生物濃度達到105 CFU/mL以上。在檢測與分選方面，微升級液滴可搭載吸光度、熒光、質(zhì)譜等各種檢測方式，實現(xiàn)細胞的多表型測試。在分選方面，常規(guī)使用的電場、光鑷等難以產(chǎn)生足夠大的驅(qū)動力將液滴分選至收集通道。本文作者團隊開發(fā)了重力場驅(qū)動微升液滴至微孔板的分選與收集方法，形成了我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的微升液滴分選技術(shù)。

我國洛陽華清天木生物科技有限公司開發(fā)了商業(yè)化微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng)MMC與高通量微升級液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)MISScell裝備。MMC系統(tǒng)主要用于微生物的連續(xù)進化研究，通過集成液滴識別、光譜檢測、微流控芯片和進樣模塊等功能，實現(xiàn)了對微生物液滴的精確操作，包括發(fā)生、培養(yǎng)、監(jiān)測、分割、融合和分選等過程。MMC液滴體積為2—3微升，一批次產(chǎn)生200個液滴培養(yǎng)單元并可連續(xù)傳代15天以上，最終分選出具有顯著生長優(yōu)勢的底盤細胞。MMC已成功應(yīng)用于耐高濃度D-山梨醇和耐高溫Gluconobacter oxydans菌株、甲醇利用型大腸桿菌等菌株適應(yīng)性進化。MISScell系統(tǒng)主要用于單細胞高通量培養(yǎng)篩選研究，每批次生成約5 000個2微升單細胞液滴，液滴存儲在高透氣性管路中進行細胞培養(yǎng)（0—8天），通過光學(xué)信號（如光學(xué)密度、熒光等）檢測分選，搭載機械臂搬運孔板，一批次最多可以收集1 000株優(yōu)良表型細胞。本文作者團隊使用帶有熒光標(biāo)記的大腸桿菌驗證了MISScell基于泊松分布包裹單細胞的可行性，并利用該裝備實現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌的高通量篩選，從502株突變體中分選出的優(yōu)勢菌株谷氨酸產(chǎn)量提高了25%以上。此外，法國MilliDrop公司的Milidrop Analyzer液滴培養(yǎng)儀也是一款微升級液滴裝備，每批次可以生成102—103個細菌、酵母等單細胞微生物液滴，在追蹤細菌在不同抗生素壓力下的適應(yīng)性進化、量化腸道細菌的多樣性等科學(xué)研究中得到應(yīng)用。

基于FADS、AADS、MADS、IADS技術(shù)原理開發(fā)的培養(yǎng)類型高通量表型測試典型商業(yè)化液滴微流控裝備如表2所示。

微腔室高通量培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

微腔室反應(yīng)器是指基于微加工技術(shù)在硅、玻璃等基板上制作微孔陣列，根據(jù)不同需求制作不同形狀的腔室，這些腔室具有無菌透氣、透明性、低毒性等特點以滿足單細胞的培養(yǎng)與代謝。例如，聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料具有疏松多孔、易于加工、生物兼容性好、透明性高等優(yōu)點，廣泛用于細胞的生長代謝觀察，其微孔體積包括皮升至微升級別，覆蓋微生物到動物細胞所需反應(yīng)器的體積。微腔室生物反應(yīng)器中的單細胞研究包括單細胞的捕獲、培養(yǎng)和檢測分選，單細胞捕獲可通過重力驅(qū)動、有限稀釋法、光電驅(qū)動等技術(shù)方法將單個細胞導(dǎo)入微腔室（圖3a），接著對微腔室周圍環(huán)境進行適宜的溫度控制和氧氣供應(yīng)，滿足細胞在微腔室中的培養(yǎng)需求，最后通過熒光顯微等技術(shù)，對細胞的生長代謝狀態(tài)進行連續(xù)觀察分析，進而挑選出合適的目標(biāo)細胞（圖3b）。

皮納升微腔室培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

皮納升微腔室是指通過數(shù)值模擬和理論分析的方法對微流控芯片尺寸進行精確設(shè)計的皮納升微小孔洞陣列。當(dāng)樣品懸液通入到芯片后，根據(jù)泊松分布原理，單個細胞會溫和分布至各個微腔室進行生長代謝，單細胞培養(yǎng)后可通過明場成像、熒光成像等檢測技術(shù)識別單克隆，并基于機械臂（Cobot）挑取、光鑷技術(shù)（optical tweezers，OT）、光電定位技術(shù)（optoelectronic positioning，OEP）將細胞轉(zhuǎn)移至特定位置。

我國青島星賽生物科技有限公司開發(fā)了數(shù)字化克隆挑選儀（DCP），該設(shè)備搭配的靜態(tài)皮升級微腔陣列芯片，可容納數(shù)萬個單細胞并行培養(yǎng)；培養(yǎng)后通過自動對焦系統(tǒng)對每個微腔室進行高分辨率成像，并基于OT技術(shù)，將單克隆包裹于微液滴中高效導(dǎo)出，通量為1 000單克隆/小時。美國Berkeley Lights Co., Ltd.開發(fā)了Beacon納升微腔室細胞表型測試系統(tǒng)，結(jié)合光流體芯片（納升級培養(yǎng)小室和微流管道構(gòu)成的流體管路系統(tǒng)）和OEP技術(shù)，實現(xiàn)了數(shù)千個單細胞并行培養(yǎng)、檢測、篩選和導(dǎo)出，在抗體篩選、免疫細胞篩選等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。英國iotaSciences公司開發(fā)了isoCell高通量、高自動化單細胞可視化培養(yǎng)系統(tǒng)，在培養(yǎng)皿上雕刻出單獨的小孔形成納升級微腔室（6厘米培養(yǎng)皿包含256個腔室）用于單細胞自動化培養(yǎng)與測試，每天測試通量達到103以上。此外，德國SARTORIUS公司的CellCelector Flex和日本AS ONE 公司的OneCell基于微腔室芯片技術(shù)，每批次可分離培養(yǎng)數(shù)十萬個單細胞，并通過偶聯(lián)目標(biāo)抗體或抗原，檢測并篩選出目標(biāo)表型細胞。

微升級腔室培養(yǎng)技術(shù)與測試裝備

微升級腔室培養(yǎng)技術(shù)通常指iChip（isolation chip）技術(shù)，核心為一種由數(shù)百個微型擴散室組成的微型隔離芯片，每個微腔室接種單個細胞后使用濾膜封閉，特定的膜孔徑使環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)、信號分子等可以通過擴散作用進入培養(yǎng)室內(nèi)，為細胞提供生長所需的養(yǎng)分，但是細胞無法侵入腔室，因此可以進行原位環(huán)境培養(yǎng)。目前，iChip一般在實驗室中自制使用，目前還未報道商業(yè)化裝備。

基于微腔室培養(yǎng)類型的單細胞高通量表型測試典型商業(yè)化裝備如表3所示。

總結(jié)與展望

本文系統(tǒng)綜述了基于微流控技術(shù)的工程細胞高通量表型測試技術(shù)與裝備，包括基于單細胞測試的非培養(yǎng)型技術(shù)與裝備，基于微液滴、微腔室的單細胞培養(yǎng)測試技術(shù)與裝備。非培養(yǎng)類型的單細胞測試通常是基于細胞自身或經(jīng)過生化反應(yīng)標(biāo)記的信號進行檢測與篩選，適用于胞內(nèi)、胞膜表型測試。培養(yǎng)類型的細胞表型測試通常需要微型生物反應(yīng)器來支持單細胞生長代謝，可以實現(xiàn)胞內(nèi)、胞膜、胞外等多種細胞表型測試?？傮w來看，在單細胞測試中，F(xiàn)ACS與MACS裝備通量最高，但是FACS受限于熒光標(biāo)簽的開發(fā)；MACS依賴細胞表面特定的標(biāo)志物才能實現(xiàn)抗原抗體結(jié)合與磁激活分選；RACS技術(shù)在去標(biāo)簽、多參數(shù)檢測上取得了重要進展，實現(xiàn)了細胞代謝產(chǎn)物、細胞形態(tài)、細胞毒性耐受等多表型測試，然而拉曼光譜仍面臨背景噪聲高、抗干擾能力差，導(dǎo)致測試準(zhǔn)確性和通量降低等方面的挑戰(zhàn)；IACS在細胞幾何結(jié)構(gòu)表型測試中表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，但深度學(xué)習(xí)算法與商業(yè)化裝備的集成仍存在局限性。對于細胞培養(yǎng)型表型測試，基于FADS、AADS、IADS、MADS技術(shù)，國內(nèi)外近年來涌現(xiàn)了大量工程細胞高通量表型測試液滴微流控裝備，在高通量、集成化、自動化、多參數(shù)檢測上取得了關(guān)鍵突破，實現(xiàn)了皮納升液滴與微升液滴不同尺度下的單細胞培養(yǎng)，然而液滴微流控裝備需結(jié)合微流控芯片操作，技術(shù)操作復(fù)雜，門檻較高。此外，微腔室裝備歷經(jīng)多年發(fā)展，也逐漸形成了單細胞捕獲、培養(yǎng)、檢測、篩選功能一體化裝備，但由于OEP、OT等細胞分離技術(shù)通量低，限制了細胞表型測試效率。對比非培養(yǎng)類型的單細胞表型測試，培養(yǎng)類型表型測試技術(shù)在細胞生長代謝、細胞環(huán)境表型測試中體現(xiàn)出更大優(yōu)勢，而單細胞的優(yōu)勢更多體現(xiàn)在通量、細胞物理參數(shù)與幾何結(jié)構(gòu)的表型測試中。

對于工程細胞表型測試微流控技術(shù)與裝備研發(fā)的發(fā)展方向，本文認(rèn)為：

發(fā)展表型組檢測集成，及其與基因型數(shù)字化關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)有微流控技術(shù)的高通量表型測試，常以單類型的檢測方式為主，如熒光檢測、拉曼檢測、圖像檢測等，但在實際實驗過程中，單一類型的表型檢測方式常無法滿足工程細胞的多維度檢測需求，從而造成表型數(shù)據(jù)單一、假陽性結(jié)果較多等問題，對后期的數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生干擾。因此，不同檢測方式的自由組合，實現(xiàn)工程細胞的多個維度表型參數(shù)同時檢測，將為工程細胞分析提供更加精確、豐富的表型數(shù)據(jù)結(jié)果。同時結(jié)合高通量建庫測序技術(shù)、生信分析技術(shù)、人工智能技術(shù)等，實現(xiàn)表型組和基因型的數(shù)字化關(guān)聯(lián)，對工程細胞進行系統(tǒng)性深度研究分析，為其改造設(shè)計提供精準(zhǔn)理性指導(dǎo)。

微流控技術(shù)與傳統(tǒng)孔板-移液機器機器人技術(shù)有機結(jié)合，鑄造工程細胞高通量表型測試裝備集成平臺。工程細胞表型測試具有多維度、跨尺度等特性，微流控表型測試技術(shù)雖然能夠支持實現(xiàn)對多個表型維度進行高通量測試，其尺度往往局限于微升級體積以下，部分表型信號較弱甚至缺乏表達。同時，對于基因型的獲得仍需經(jīng)過PCR擴增、核酸提取等手段獲得核酸樣本，工作量大且過程較為煩瑣。現(xiàn)有的機器人移液技術(shù)及孔板自動操控技可以提供孔板水平（百微升—毫升級）規(guī)模的移液操作和檢測，能夠有效解決微流控表型測試及篩選后下游的煩瑣和受限工作。因此，微流控技術(shù)與傳統(tǒng)孔板-移液機器機器人技術(shù)的有機結(jié)合，實現(xiàn)以多孔板為標(biāo)準(zhǔn)物理接口的自動化對接，有望為工程細胞高通量表型測試和表型-基因型數(shù)字化關(guān)聯(lián)提供一站式的完整解決方案。同時，結(jié)合具體典型應(yīng)用場景中工程細胞的實驗流程，串聯(lián)多種不同關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)工程細胞測試的全流程固化，實現(xiàn)工程細胞高通量表型測試自動化平臺。

在科學(xué)儀器的國產(chǎn)化研究方面，歷經(jīng)幾十年不斷發(fā)展，特別是“十二五”以來，在國家自然科學(xué)基金科研儀器專項和科學(xué)技術(shù)部科研儀器專項的支持下，我國儀器裝備行業(yè)已經(jīng)逐步形成了相對完善的科技創(chuàng)新體系，取得重要突破。然而，國際科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)仍然以發(fā)達國家主導(dǎo)，美國、歐洲和日本的企業(yè)占據(jù)了高端市場的主要份額，我國科學(xué)儀器行業(yè)面臨著以下關(guān)鍵問題：科學(xué)儀器對國外依存度高，國產(chǎn)儀器使用率不高；產(chǎn)業(yè)發(fā)展集聚度低，缺少行業(yè)龍頭企業(yè)；科學(xué)儀器自主研制面臨管控禁運的挑戰(zhàn)。

因此，對于我國高端儀器裝備的發(fā)展，提出以下建議，以期最終實現(xiàn)我國科學(xué)儀器領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力和產(chǎn)業(yè)競爭力提高：堅定自主研究戰(zhàn)略；以大科學(xué)設(shè)施集群為引領(lǐng)，推動空間集聚發(fā)展；堅持科學(xué)引領(lǐng)，制造技術(shù)、資本支持協(xié)同提升；加大專業(yè)人才隊伍建設(shè)力度；堅持資源統(tǒng)籌，持續(xù)完善創(chuàng)新生態(tài)。

（作者：李爽、陳海博、陳思思、笪鑫、劉芹秀、王怡，清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點實驗室；郭肖杰，洛陽華清天木生物科技有限公司；李崢輝，北京聯(lián)合大學(xué)；邢新會，清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點實驗室 清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心 清華大學(xué)深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院；張翀，清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點實驗室清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心。《中國科學(xué)院院刊》供稿）