中國網(wǎng)/中國發(fā)展門戶網(wǎng)訊 基因編輯技術(shù)的誕生與發(fā)展為生命科學(xué)研究帶來了深遠(yuǎn)的影響，其精準(zhǔn)操控基因組的能力已成為推動基礎(chǔ)研究和應(yīng)用科學(xué)的重要工具。自其誕生以來，基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了從基礎(chǔ)工具的創(chuàng)制到系統(tǒng)性平臺構(gòu)建的深刻變革。特別是近年來，研究人員通過活性優(yōu)化和功能擴(kuò)展，顯著提升了基因編輯工具的效率和適用性，使其從基礎(chǔ)研究走向了更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，包括合成生物學(xué)、生物育種和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等。

隨著學(xué)界對生命系統(tǒng)復(fù)雜性理解的加深和技術(shù)需求的多樣化，基因編輯技術(shù)正朝著更高精準(zhǔn)度、更低脫靶效應(yīng)，以及更廣泛應(yīng)用場景的方向發(fā)展。本文回顧了基因編輯工具的發(fā)展歷史，梳理了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)與關(guān)鍵進(jìn)展，并對未來的技術(shù)發(fā)展方向進(jìn)行了展望，以期為相關(guān)領(lǐng)域的未來探索提供有益的借鑒與啟發(fā)。

基因編輯工具開發(fā)的歷史回顧

基因編輯工具開發(fā)的歷史背景

在19世紀(jì)中后期至20世紀(jì)初，孟德爾的一系列豌豆雜交實(shí)驗(yàn)為遺傳學(xué)的初步建立和發(fā)展奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。伴隨著DNA被證實(shí)承載著遺傳信息、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立、中心法則的提出，以及DNA測序和擴(kuò)增技術(shù)的相繼發(fā)展，遺傳學(xué)漸漸邁入了分子層面，研究者們逐步更加關(guān)注基因型與表型之間的內(nèi)在聯(lián)系，并著力于通過遺傳操作驗(yàn)證基因功能等。然而，通過輻射誘變或化學(xué)誘變方法對基因序列進(jìn)行修改的方式特異性差，且效率較低，難以滿足研究需求。如何實(shí)現(xiàn)基因的靶向編輯成了研究人員關(guān)注的重要問題。20世紀(jì)70年代，斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)向釀酒酵母中導(dǎo)入了與基因組靶標(biāo)區(qū)域存在同源性的人工DNA序列，通過釀酒酵母自身的同源重組機(jī)制，使人工構(gòu)建的DNA序列靶向替代了染色體中的目標(biāo)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母染色體中的定點(diǎn)基因整合?；谶@一機(jī)制，研究人員后續(xù)又在哺乳動物細(xì)胞和模式動物中實(shí)現(xiàn)了基因的靶向操縱，但是這些基因操縱方式往往需要大規(guī)模的基因型或表型篩選操作，面臨著步驟煩瑣、效率較低等問題。

基因編輯底層技術(shù)的開發(fā)

20世紀(jì)80年代，為了實(shí)現(xiàn)更為簡便高效的基因編輯，研究人員關(guān)注到了可識別較長DNA序列的限制性內(nèi)切酶，如來自釀酒酵母第一類內(nèi)含子的巨核酸酶I-SceI，其可特異性識別DNA序列，并切割產(chǎn)生DNA斷裂，進(jìn)一步可通過細(xì)胞內(nèi)源修復(fù)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因編輯。目前，研究人員已基于巨核酸酶技術(shù)，在動植物系統(tǒng)中均實(shí)現(xiàn)了基因的靶向編輯。然而，巨核酸酶通過特定的蛋白質(zhì)序列來識別DNA，并對靶向位點(diǎn)造成切割，重編程核酸酶靶向新的DNA位點(diǎn)涉及蛋白質(zhì)的改造，通常比較困難，從而使得編輯窗口較為局限。如何實(shí)現(xiàn)可編程化的基因操縱成了領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。為此，研究人員針對基因的靶向識別和切割過程，設(shè)計了相應(yīng)的模塊，并通過有機(jī)組合，形成了一系列的可編程基因編輯底盤工具。

1996年，美國約翰斯·霍普金斯大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在具備DNA特異性識別功能的鋅指蛋白模塊基礎(chǔ)上，融合表達(dá)核酸內(nèi)切酶Fok I模塊，創(chuàng)制了鋅指核酸酶（ZFN）基因編輯技術(shù)，其中的鋅指蛋白模塊包含多個鋅指單元，每個單元可負(fù)責(zé)識別3個堿基對，通過串聯(lián)多個識別相應(yīng)堿基三聯(lián)體的單元模塊，即可精準(zhǔn)識別較長的DNA序列，從而引導(dǎo)核酸酶模塊，對感興趣的核酸位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)靶向切割。類似地，隨著轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子（TALE）識別DNA序列的模式被破譯，學(xué)界將核酸內(nèi)切酶Fok I模塊與TALE融合，形成了新的基因靶向編輯技術(shù)TALEN。通過改變TALE蛋白重復(fù)單元兩個關(guān)鍵氨基酸，即可使TALE靶向感興趣的目標(biāo)DNA序列，與ZFN技術(shù)相比，其分子設(shè)計更加簡單?；谶@些技術(shù)，學(xué)界已在哺乳動物細(xì)胞、果蠅、斑馬魚和擬南芥等生物系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了基因編輯。

與巨核酸酶相比，ZFN和TALEN盡管在一定程度上提升了基因編輯工具使用的靈活性，但這些技術(shù)均依賴于蛋白質(zhì)和DNA之間的復(fù)雜相互作用，來識別核酸底物，如需靶向新的基因位點(diǎn)，則需要對DNA序列特異性識別蛋白模塊進(jìn)行重編程和合成，這往往涉及對系統(tǒng)的深入理解、實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)及篩選試錯過程等，煩瑣且耗時。CRISPR-Cas技術(shù)的出現(xiàn)為基因編輯領(lǐng)域帶來了重大變革。這項(xiàng)技術(shù)擺脫了巨核酸酶、ZFN和TALEN基因編輯工具在DNA識別過程中對蛋白質(zhì)的需求，是一種由RNA引導(dǎo)的DNA靶向編輯技術(shù)，為基因編輯帶來了全新的分子底盤。2012—2013年，來自美國和法國的多個研究團(tuán)隊(duì)報道了CRISPR-SpCas9系統(tǒng)可用于靶向基因編輯。CRISPR-SpCas9系統(tǒng)包含負(fù)責(zé)執(zhí)行DNA切割功能的SpCas9蛋白和引導(dǎo)RNA，其中的引導(dǎo)RNA可與靶標(biāo)DNA通過堿基互補(bǔ)配對相結(jié)合，具有優(yōu)良的可編程性，可根據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行自由設(shè)計。由于該系統(tǒng)簡便的分子架構(gòu)和設(shè)計方式，以及較高的基因編輯效率，其應(yīng)用出現(xiàn)了爆發(fā)式的增長，被廣泛用于基礎(chǔ)研究、微生物工程化改造、農(nóng)作物育種，以及疾病治療等多種場景。

此外，研究者們還對CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行了廣泛的挖掘鑒定，以及深入的活性和機(jī)理表征等。目前已鑒定到的CRISPR-Cas系統(tǒng)主要可分為兩類，其中Ⅰ類具有多蛋白組分效應(yīng)器，Ⅱ類則具有單一蛋白組分效應(yīng)器。由于Ⅱ類系統(tǒng)的分子構(gòu)造更為簡潔，在應(yīng)用層面具有更大的優(yōu)勢，研究者們主要關(guān)注于此類系統(tǒng)。例如，常用于DNA靶向切割的Cas9和Cas12a系統(tǒng)，以及用于RNA靶向切割的Cas13a/b系統(tǒng)等。這些發(fā)現(xiàn)為基因靶向敲除、敲入、敲低等提供了有效的分子工具，擴(kuò)充了CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用場景和維度。

CRISPR-Cas基因編輯工具存在著多種限制

雖然傳統(tǒng)的巨核酸酶、ZFN、TALEN及CRISPR-Cas系統(tǒng)中的SpCas9、Cas12a和Cas13a/b等工具為基因的靶向操縱提供了有效解決方案，但也面臨著諸多問題。特別是現(xiàn)已成為基因編輯領(lǐng)域核心技術(shù)的CRISPR-Cas系統(tǒng)，在應(yīng)用中仍面臨多種挑戰(zhàn)：Cas蛋白的長度通常超過了1 000個氨基酸，對應(yīng)的編碼序列較長，給細(xì)胞遞送帶來了挑戰(zhàn)。 CRISPR-Cas系統(tǒng)在識別靶標(biāo)DNA時，還需要靶標(biāo)區(qū)域附近的序列滿足PAM序列要求。例如，SpCas9偏好G富集的PAM序列，從而限制了在基因組中可選的編輯窗口范圍。CRISPR-Cas技術(shù)還面臨著脫靶效應(yīng)以及免疫反應(yīng)性等問題，亦在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，研究人員展開了多方面的探索，包括廣泛的新型系統(tǒng)挖掘與改造、開發(fā)精準(zhǔn)編輯工具和插入工具，以及開發(fā)基于RNA的基因編輯工具等，形成了維度多樣化的新型基因編輯工具開發(fā)模式。

新型基因編輯工具開發(fā)的模式

CRISPR-Cas系統(tǒng)的擴(kuò)展與優(yōu)化

CRISPR-Cas系統(tǒng)中負(fù)責(zé)底物切割的Cas蛋白通常編碼序列較長，使其在高效的細(xì)胞遞送方面面臨挑戰(zhàn)，這也是其應(yīng)用中存在的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。對此，研究者們積極開展數(shù)據(jù)挖掘，力圖發(fā)現(xiàn)新型的小型CRISPR-Cas系統(tǒng)，從而推動基因編輯技術(shù)的更廣泛應(yīng)用。2019年，美國加州大學(xué)伯克利分校的團(tuán)隊(duì)對一類來自非致病菌的小型CRISPR-Cas12e（CasX）核酸酶進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有TTCN的PAM序列偏好性，且在細(xì)菌和人源細(xì)胞中都具有編輯活性。值得注意的是，CasX與傳統(tǒng)的Cas9和Cas12a系統(tǒng)截然不同，其引導(dǎo)RNA相對較大，而Cas蛋白組分則較小，且包含全新的結(jié)構(gòu)域，整體呈現(xiàn)出了全新的分子構(gòu)象，代表著一類新型的基因編輯系統(tǒng)。2020年，立陶宛維爾紐斯大學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了超迷你型Cas12f核酸酶（含有約400—600個氨基酸），這一新型核酸酶被證明在細(xì)菌中具有雙鏈DNA切割活性，且具有T或C富集的PAM序列偏好性，拓展了在基因組中的可靶向范圍。輝大（上海）生物科技有限公司（以下簡稱“輝大基因”）研發(fā)團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了兩種在哺乳動物細(xì)胞中基因編輯效率最高超過90%的新型CRISPR-Cas12f系統(tǒng)——enOsCas12f1和enRhCas12f1?；谇罢撸邪l(fā)團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了活性可被精確調(diào)控的DD-enOsCas12f1系統(tǒng)、表觀編輯工具miniCRISPRoff，以及基因表達(dá)激活工具denOsCas12f1-VPR。此外，2023年，清華大學(xué)團(tuán)隊(duì)綜合生物信息學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多學(xué)科方法，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一類來源于非致病菌的小型CRISPR-Casπ系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有約860個氨基酸，具有C富集的PAM序列，能夠耐受廣譜的生化條件，并在哺乳動物細(xì)胞中展現(xiàn)了顯著的基因編輯活性。研究人員進(jìn)一步利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析了CRISPR-Casπ系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)特征顯著不同于已知系統(tǒng)，有望成為未來微生物和動植物基因編輯工作的又一得力工具。這些創(chuàng)新不僅豐富了基因編輯工具箱，也為基因編輯技術(shù)進(jìn)入“迷你時代”奠定了基礎(chǔ)。

針對CRISPR-Cas系統(tǒng)脫靶效應(yīng)和部分系統(tǒng)活性較低的問題，學(xué)界則從蛋白質(zhì)和RNA兩個維度，展開了廣泛探索，以創(chuàng)制精準(zhǔn)高效基因編輯工具，滿足應(yīng)用場景需求。在蛋白質(zhì)方面，定向進(jìn)化作為一種常用的工程改造方法，通過引入隨機(jī)突變，構(gòu)建包含大量突變體的文庫，并結(jié)合高效篩選策略，篩選出具有顯著功能提升的突變體。韓國研究團(tuán)隊(duì)即通過這種思路，對Cas9進(jìn)行了優(yōu)化，在不損失在靶效率的情況下，降低了脫靶效應(yīng)，提升了特異性。此外，隨著對Cas蛋白三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的深入了解，基于理性設(shè)計和半理性設(shè)計對Cas蛋白進(jìn)行工程化改造，逐漸成為一種優(yōu)化提升CRISPR-Cas系統(tǒng)的有力手段。美國Broad研究所研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注于Cas9蛋白與DNA底物結(jié)合的區(qū)域，對正電荷氨基酸進(jìn)行丙氨酸替換篩選，獲得了高特異性的Cas9編輯工具。類似地，美國的其他多個研究團(tuán)隊(duì)也獲得了多種高特異性的Cas核酸酶工具。在RNA方面，2022年清華大學(xué)與加州大學(xué)伯克利分校團(tuán)隊(duì)合作，利用冷凍電鏡解析PlmCasX的三維結(jié)構(gòu)，并與DpbCasX進(jìn)行對比，揭示了二者在體內(nèi)外DNA切割活性差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并通過對引導(dǎo)RNA的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，顯著提高了DpbCasX和PlmCasX的基因編輯效率，為CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)化與改造提供了新的思路。德國研究團(tuán)隊(duì)也關(guān)注于RNA，通過設(shè)計其恒定區(qū)域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并引入化學(xué)修飾，有效提高了gRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少了錯誤折疊的風(fēng)險，并增強(qiáng)了抗核酸酶降解能力，提高了基因編輯效率。

除了對CRISPR-Cas系統(tǒng)本身進(jìn)行挖掘和優(yōu)化之外，學(xué)界還對可與CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)生相互作用來提升其活性的輔助元件進(jìn)行了挖掘。2024年，清華大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性地分析了Cas9蛋白的分子進(jìn)化軌跡，并據(jù)此鑒定到了一類新型基因編輯輔助元件PcrIIC1。結(jié)果表明，PcrIIC1蛋白可以通過二聚化與CbCas9形成CbCas9-PcrIIC1異源四聚體，從而增強(qiáng)CRISPR-CbCas9系統(tǒng)對靶標(biāo)DNA的搜尋、結(jié)合和切割效率，提高細(xì)菌對噬菌體的抵抗能力，為基于新型輔助元件的高效CRISPR-Cas基因編輯工具開發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

堿基編輯

單核苷酸變異是影響人類疾病及動植物經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵遺傳因素。如何更加高效、精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)基因組中的堿基替換，以應(yīng)對單核苷酸變異，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究核心之一。堿基編輯（BE）技術(shù)是基于CRISPR-Cas系統(tǒng)開發(fā)的新型精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)，通過將沒有酶切活性的Cas蛋白或僅具有單鏈切割活性的Cas蛋白與堿基修飾酶融合，從而在不引入雙鏈斷裂的情況下，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因堿基的精確替換。

2016年，哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在這一思路的基礎(chǔ)上，對脫氨酶種類、融合位置及連接方式進(jìn)行了優(yōu)化，形成了第一代工具BE1。研究表明，編輯所產(chǎn)生的U堿基容易被尿嘧啶DNA糖基酶識別并切除，導(dǎo)致無堿基位點(diǎn)的形成，從而引發(fā)非預(yù)期的插入或刪除。為提升目標(biāo)編輯效率，該團(tuán)隊(duì)又采取了融合尿嘧啶糖基酶抑制劑，以及用具有單鏈切割活性的nCas9替代無切割活性dCas9的策略，獲得了BE2和BE3工具。接下來，該團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步增加了UGI的融合次數(shù)，推出了第4代工具BE4，并通過對BE4進(jìn)行密碼子優(yōu)化并引入核定位序列，進(jìn)一步提高了工具的效率，最終開發(fā)出了堿基編輯工具BE4max。

研究顯示，大多數(shù)單堿基遺傳病是由G到A的突變引起的，而胞嘧啶堿基編輯器（CBE）僅能實(shí)現(xiàn)C到T的點(diǎn)突變，因此研究者開始著眼于腺嘌呤堿基編輯器（ABE）系統(tǒng)的開發(fā)。然而，自然界并沒有已知的DNA腺嘌呤脫氨酶。為此，哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)挑選大腸桿菌來源的TadA脫氨酶，通過抗生素篩選系統(tǒng)進(jìn)行定向進(jìn)化，最終篩選出了人工進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶。該腺嘌呤脫氨酶與nCas9融合，在RNA引導(dǎo)下可靶向基因組DNA，實(shí)現(xiàn)A到G的定點(diǎn)突變。

值得注意的是，2023年，為了克服現(xiàn)有堿基編輯器面臨的可選工具底盤有限、系統(tǒng)體積較大，以及存在脫靶效應(yīng)等問題，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所聯(lián)合蘇州齊禾生科生物科技有限公司研究團(tuán)隊(duì)通過大規(guī)模蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和聚類，對脫氨酶開展了深入挖掘，鑒定到了全新的脫氨酶底盤工具，并開發(fā)出了高活性、高特異性的新型堿基編輯器，為動植物中的廣泛應(yīng)用提供了新的工具。此外，在2024年，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、輝大基因和北京大學(xué)還采取了摒棄使用脫氨酶的傳統(tǒng)編輯模式，轉(zhuǎn)而使用DNA糖基酶進(jìn)行堿基切除，并依賴細(xì)胞內(nèi)源的修復(fù)機(jī)制完成堿基編輯，分別實(shí)現(xiàn)了對胸腺嘧啶的靶向編輯，拓展了現(xiàn)有的堿基編輯模式。

重要的是，堿基編輯器的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)CRISPR-Cas系統(tǒng)的限制，將其從原本的DNA切割“手術(shù)刀”升級為能夠精確修正特定堿基的“修正液”。由于其所具有的高效、不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂、不需要供體DNA等優(yōu)點(diǎn)，在精準(zhǔn)醫(yī)療和作物育種等領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，例如用于血色素沉著癥、肌營養(yǎng)不良癥、癌癥、罕見肝病等疾病的治療，以及用于賦予農(nóng)作物除草劑抗性等多元化場景。

先導(dǎo)編輯

2019年，美國哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)為了拓展精準(zhǔn)基因編輯模式，并實(shí)現(xiàn)小片段DNA的靶向插入與刪除，對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了創(chuàng)新性的改造：一方面在RNA末端加入了引物結(jié)合位點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)錄模板序列，另一方面，將具有單鏈切割活性的Cas9與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，形成了先導(dǎo)編輯器（PE）。這一新型工具可不依賴DNA雙鏈斷裂或DNA供體，在人類細(xì)胞中進(jìn)行小片段的靶向插入、刪除及各種堿基替換，為精準(zhǔn)基因編輯開辟了新的方向。

初始版本PE1的編輯效率相對較低，因此該研究團(tuán)隊(duì)通過對逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行突變，推出了PE2版本，提高了編輯效率。研究人員還增加了可介導(dǎo)互補(bǔ)鏈切割的引導(dǎo)RNA，輔以進(jìn)一步優(yōu)化，開發(fā)了PE3和PE3b版本，進(jìn)一步提升了編輯效率，降低了非目標(biāo)插入或刪除的比率。2021年，美國哈佛大學(xué)與普林斯頓大學(xué)的合作團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復(fù)途徑在一定程度上抑制了先導(dǎo)編輯的效率和精確性。通過對此途徑進(jìn)行抑制，研究人員觀察到編輯效率的顯著提升?；谶@一發(fā)現(xiàn)，他們在PE2和PE3的基礎(chǔ)上，共表達(dá)錯配修復(fù)途徑抑制蛋白，開發(fā)了PE4和PE5系統(tǒng)，使編輯效率分別提高了7.7倍和2倍。進(jìn)一步通過密碼子優(yōu)化、Cas9的氨基酸突變及增加核定位序列，開發(fā)了PEmax系統(tǒng)，再次提升了編輯效率。在與鐮狀細(xì)胞貧血癥等疾病治療相關(guān)的6個基因靶點(diǎn)上進(jìn)行編輯測試時，PE4max和PE5max均顯示出顯著的編輯效率提升和非目標(biāo)插入或刪除效應(yīng)的降低。2023年，美國哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過噬菌體輔助進(jìn)化技術(shù)對原始PE進(jìn)行定向進(jìn)化，又獲得了具有全新逆轉(zhuǎn)錄酶的PE6，與PEmax相比分子尺寸更小，且效率更高。2024年，美國普林斯頓大學(xué)的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了與PE編輯效率密切相關(guān)的La小RNA結(jié)合蛋白，其可以結(jié)合PE系統(tǒng)中RNA組分的3’末端，從而可能通過提高RNA的穩(wěn)定性來提高編輯效率，并據(jù)此開發(fā)了PE7系統(tǒng)，在多個疾病治療相關(guān)靶點(diǎn)和3種細(xì)胞系中，證明其具有顯著的效率提升。

先導(dǎo)編輯技術(shù)已經(jīng)在動植物細(xì)胞等多種生物系統(tǒng)中表現(xiàn)出了強(qiáng)大的精準(zhǔn)基因編輯能力。在植物領(lǐng)域，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的團(tuán)隊(duì)率先在水稻和小麥兩種重要農(nóng)作物中開發(fā)并優(yōu)化了植物先導(dǎo)編輯器；此后，又在水稻全基因組范圍內(nèi)評估了先導(dǎo)編輯的脫靶效應(yīng)，證明該系統(tǒng)具有較高的特異性和安全性，還對系統(tǒng)設(shè)計進(jìn)行了優(yōu)化，為其在植物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。接下來，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行了改造，并引入了病毒核衣殼蛋白元件，作為核酸的分子伴侶，顯著提升了植物基因編輯效率，同時未發(fā)現(xiàn)非目標(biāo)編輯效應(yīng)的顯著增加?；谶@一技術(shù)，團(tuán)隊(duì)還成功培育了可耐受除草劑的水稻植株，為先導(dǎo)編輯在農(nóng)業(yè)育種、作物改良等相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了優(yōu)良范式。

與此同時，先導(dǎo)編輯技術(shù)的臨床應(yīng)用也在快速推進(jìn)。目前，其已在杜氏肌營養(yǎng)不良癥、先天性黑蒙癥、酪氨酸血癥、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥和苯丙酮尿癥等疾病模型中被證明有效。2024年，PE基因編輯療法獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，將開展1/2期臨床試驗(yàn)，用于治療慢性肉芽腫病，旨在評估其在兒童和成年患者中的安全性和有效性。這標(biāo)志著先導(dǎo)編輯技術(shù)在基因治療中的潛力正得到越來越廣泛的認(rèn)可，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)打開了新的局面。

基因插入工具

盡管PE系統(tǒng)可以用于DNA的靶向插入，但是可插入的片段通常較短，大約僅為50個堿基對，而2023年報道的TJ-PE系統(tǒng)則可在哺乳動物細(xì)胞中靶向插入約為800個堿基對的DNA片段，整體而言，僅依賴于PE系統(tǒng)尚不能滿足大片段靶向插入需求。為拓展核酸插入工具箱，近年來學(xué)界關(guān)注于轉(zhuǎn)座子等系統(tǒng)，創(chuàng)制了一系列的基因片段靶向插入系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)座子是一類可以在基因組中跳躍的天然可移動元件，根據(jù)轉(zhuǎn)座中間體的不同，可分為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。其中，前者會先通過轉(zhuǎn)錄得到RNA，之后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，插入到新的靶標(biāo)位點(diǎn)；而后者則被從原始位點(diǎn)剪切出來，以DNA的形式直接插入新的位點(diǎn)。

2023年，清華大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注于R2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，闡明了其RNA組分調(diào)控轉(zhuǎn)座過程的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上對系統(tǒng)進(jìn)行了改造設(shè)計，在哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因片段靶向插入。此項(xiàng)研究通過冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析獲得了R2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在不同狀態(tài)下的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，并綜合運(yùn)用生物化學(xué)手段驗(yàn)證，表明R2逆轉(zhuǎn)座子的mRNA中具有兩段結(jié)構(gòu)性的RNA，可調(diào)控兩條靶標(biāo)DNA鏈的先后切割次序，以巧妙地保障基因片段通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座反應(yīng)插入新的靶標(biāo)位點(diǎn)。進(jìn)一步，基于對RNA結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知，該團(tuán)隊(duì)還對RNA進(jìn)行了精簡，在HEK293T細(xì)胞中靈敏地檢測到了有效基因插入事件的發(fā)生，從而為開發(fā)新的基因插入工具奠定了重要基礎(chǔ)。同一時期，美國Broad研究所團(tuán)隊(duì)也解析了R2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組中進(jìn)行靶向插入的機(jī)制，并嘗試了通過Cas9引導(dǎo)，對靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的序列插入，亦為開發(fā)基于轉(zhuǎn)座子的基因插入工具帶來了新的啟發(fā)。2024年，中國科學(xué)院動物研究所的研究團(tuán)隊(duì)還針對R2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了系統(tǒng)性的挖掘和分析，并在哺乳動物細(xì)胞中構(gòu)建了基因插入活性篩選系統(tǒng)，成功鑒定到了一種來源于鳥類基因組的R2Tg系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)成員進(jìn)一步通過工程化改造，獲得了en-R2Tg系統(tǒng)，并在人類肝細(xì)胞中觀察到可達(dá)25%的基因整合效率，在小鼠胚胎中的基因整合效率更是超過了60%，從而建立了一套高效精準(zhǔn)的基因?qū)懭爰夹g(shù)，為基因靶向插入提供了新的底盤工具。類似地，美國加州大學(xué)伯克利分校的研究團(tuán)隊(duì)也在2024年，基于R2系統(tǒng)建立了名為PRINT的精準(zhǔn)插入技術(shù)，在人類原代細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了基因靶向插入。

針對DNA轉(zhuǎn)座子，美國Broad研究所的團(tuán)隊(duì)于2019年，在藍(lán)藻中鑒定出了與CRISPR-Cas系統(tǒng)偶聯(lián)的Tn7樣轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，被稱為CAST系統(tǒng)（CRISPR-associated Tn7 transposon）；其中的Tn7樣轉(zhuǎn)座酶可以與CRISPR-Cas系統(tǒng)相互作用，并通過其引導(dǎo)，在大腸桿菌中向靶標(biāo)位點(diǎn)插入長達(dá)10 kb的DNA片段。同年，美國哥倫比亞大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在霍亂弧菌中，也鑒定到了類似的系統(tǒng)，并在細(xì)菌中證實(shí)其具有精準(zhǔn)的DNA片段插入能力。

除了上述介紹的系統(tǒng)，研究人員還采取了單鏈DNA退火蛋白與Cas9偶聯(lián)或PE系統(tǒng)與整合酶聯(lián)用等策略，在人類細(xì)胞和植物細(xì)胞等場景中亦實(shí)現(xiàn)了基因的靶向插入。值得一提的是，Arc研究所團(tuán)隊(duì)關(guān)注于插入序列元件，在2024年又報道了一種由橋式RNA引導(dǎo)的重組酶，可執(zhí)行DNA靶向插入、刪除，以及倒位，并且具有良好的重編程能力，展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。此外，學(xué)界目前還在大量挖掘可以執(zhí)行多維度基因編輯的新型底盤工具。2024年，中國科學(xué)院動物研究所的研究團(tuán)隊(duì)建立了生物信息學(xué)挖掘流程，在無脊椎和脊椎動物基因組中鑒定到了大量具有潛在活性的DNA轉(zhuǎn)座子，并進(jìn)一步在人類細(xì)胞中建立了的高通量篩選平臺，發(fā)現(xiàn)了40個具有轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子，極大地擴(kuò)充了現(xiàn)有的活躍DNA轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫，為基因片段插入相關(guān)的應(yīng)用場景提供了大量新型可選工具。

以RNA為基礎(chǔ)的基因編輯工具

2024年，清華大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注于第二類內(nèi)含子，首次鑒定到了一類可通過水解機(jī)制，執(zhí)行DNA靶向切割的RNA核酶，并在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中，分別證實(shí)其具備DNA切割能力，為基因編輯提供了全新的分子平臺。第二類內(nèi)含子也是一類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其編碼的內(nèi)含子RNA，可在細(xì)菌或真核細(xì)胞器中的DNA上，通過“復(fù)制—粘貼”的方式，在靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。這段內(nèi)含子RNA通常包含結(jié)構(gòu)性元件和蛋白質(zhì)編碼序列兩部分，后者所編碼的蛋白質(zhì)分子可與RNA的結(jié)構(gòu)性元件部分結(jié)合，在宿主的DNA序列中靶向并切割目標(biāo)位點(diǎn)，發(fā)生逆轉(zhuǎn)座擴(kuò)增，形成多個拷貝。有趣的是，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)盡管一些第二類內(nèi)含子RNA僅包含結(jié)構(gòu)性元件，不含蛋白質(zhì)編碼序列，無法翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子，但仍具有多個拷貝，暗示這些結(jié)構(gòu)性的RNA分子，可能依賴自身，即可完成靶標(biāo)位點(diǎn)的識別和切割，以促進(jìn)其擴(kuò)增。

基于這一大膽假設(shè)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了系統(tǒng)性的挖掘，在多種細(xì)菌中鑒定到了這種類型的RNA，并通過深入的體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，首次證實(shí)了RNA分子可通過水解機(jī)制靶向切割DNA，并將這一類全新發(fā)現(xiàn)的RNA分子命名為水解型核酸內(nèi)切核酶（HYER）。接下來，團(tuán)隊(duì)成員在大腸桿菌和HEK293T細(xì)胞中開展了活性驗(yàn)證，鑒定出了在兩套實(shí)驗(yàn)體系中均具備DNA靶向切割能力的HYER1分子。此外，團(tuán)隊(duì)成員還通過冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析獲得了HYER1的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，并據(jù)此進(jìn)行了多種理性設(shè)計，有效提高了對靶標(biāo)序列識別的特異性和切割活性，證明HYER1分子可以兼容多維度的分子設(shè)計，具有良好的改造能力，可用于多種基因編輯場景。這項(xiàng)研究工作不僅首次報道了一類全新的第二類內(nèi)含子RNA核酶，擴(kuò)充了RNA分子數(shù)據(jù)庫，更新了科學(xué)界對RNA功能的理解，也革新了傳統(tǒng)的基因編輯工具開發(fā)模式，將基因編輯所需的DNA識別和切割能力都集成在了單一而簡潔的RNA分子上，為開發(fā)基于RNA的全新基因編輯平臺提供了堅實(shí)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和應(yīng)用潛力。

基因編輯技術(shù)未來關(guān)鍵創(chuàng)新方向展望

智能化基因編輯工具的開發(fā)與應(yīng)用

隨著人工智能技術(shù)的迅速發(fā)展，智能化基因編輯工具的開發(fā)正在成為推動基因編輯領(lǐng)域進(jìn)步的重要因素。人工智能輔助的基因編輯工具優(yōu)化，有望提高編輯效率和特異性，為研究人員提供更加高效、精準(zhǔn)的解決方案，從而可以強(qiáng)有力地推動基礎(chǔ)生物學(xué)研究、工程化菌株改造、復(fù)雜疾病的精準(zhǔn)治療和農(nóng)作物性狀改良等領(lǐng)域的快速發(fā)展。

在基因編輯工具的優(yōu)化方面，已有的部分工具雖然表現(xiàn)出了較高的基因編輯能力，但在實(shí)際應(yīng)用過程中，在特定生物體內(nèi)的編輯場景下，編輯效率和特異性仍存在提升空間。人工智能輔助的新型功能元件挖掘和設(shè)計方法，已經(jīng)在多項(xiàng)工作中幫助研究人員發(fā)現(xiàn)了全新的高效精準(zhǔn)編輯工具，能夠克服傳統(tǒng)工具面臨的局限性。進(jìn)一步拓展人工智能在工具開發(fā)和優(yōu)化方面的應(yīng)用，將有助于為復(fù)雜生物系統(tǒng)中的精確操作提供更多解決方案。在靶點(diǎn)選擇方面，基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法，可以整合基因組序列、表觀遺傳修飾和三維基因組結(jié)構(gòu)等信息，優(yōu)化功能性靶點(diǎn)的選擇，同時盡可能規(guī)避脫靶效應(yīng)。這種多層次的整合分析不僅能夠加速應(yīng)用推進(jìn)和效果評估，還能提高編輯的安全性。未來，隨著人工智能技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，智能化基因編輯工具將為生命科學(xué)研究開辟更多可能性。

多維度基因編輯工具開發(fā)

現(xiàn)有基因編輯技術(shù)主要集中在DNA層面的操作，近年來，RNA層面的靶向編輯工具開發(fā)與應(yīng)用也逐步吸引了學(xué)界的注意。與DNA編輯相比，RNA編輯具有暫時性和可逆性的特點(diǎn)，在需要短期干預(yù)的場景中更具優(yōu)勢，同時其無需對遺傳物質(zhì)進(jìn)行直接修改，也具有更加優(yōu)良的安全性。此外，RNA編輯工具還可用于對功能性非編碼RNA進(jìn)行調(diào)控，拓展基因編輯操作的維度，為多元應(yīng)用需求提供更多選擇。未來的研究還可進(jìn)一步拓展到蛋白質(zhì)層面。例如，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行人為調(diào)控，從而影響其催化功能或與其他生物分子的相互作用，進(jìn)而得以對復(fù)雜的生命系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精細(xì)操縱，形成一套多維度整合的全鏈條式編輯工具系統(tǒng)，為生物體系的全局化理解提供強(qiáng)有力的底盤工具支撐。

遞送方式優(yōu)化與安全性提升

基因編輯技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用不僅依賴于編輯工具本身的性能，還高度依賴于遞送系統(tǒng)的效率和安全性。遞送方式的優(yōu)化與安全性提升亦是未來基因編輯技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

當(dāng)前，基因編輯工具的遞送方式主要包括病毒載體（如腺病毒和慢病毒）、非病毒載體（如脂質(zhì)納米顆粒和電穿孔，以及直接注射核酸或核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物）。盡管這些方法在不同場景下各有優(yōu)勢，但在遞送效率、組織特異性和免疫原性方面仍存在改進(jìn)空間。此外，基因編輯的脫靶效應(yīng)可能引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而遞送系統(tǒng)的不精準(zhǔn)性會進(jìn)一步放大這一風(fēng)險。因此，提高編輯工具的空間和時間特異性具有重要意義。例如，可利用高靶向性的配體或抗體修飾遞送載體，來實(shí)現(xiàn)對特定組織或細(xì)胞的精準(zhǔn)遞送。此外，光控、熱控和化學(xué)小分子誘導(dǎo)的靶向激活或釋放系統(tǒng)也是學(xué)界關(guān)注的研究熱點(diǎn)，這些系統(tǒng)能夠在特定刺激下激活編輯工具，從而減少對非目標(biāo)組織的影響。而在臨床應(yīng)用方面，遞送方式的選擇和優(yōu)化還需要考慮復(fù)雜組織環(huán)境中的障礙，如血腦屏障和腫瘤微環(huán)境等。上述問題的不斷優(yōu)化和解決，將有效提升基因編輯工具的有效性和安全性，加速基因編輯技術(shù)的臨床和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

（作者：劉子賢、李承平、劉俊杰，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 清華大學(xué)北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心 清華大學(xué)膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心?！吨袊茖W(xué)院院刊》供稿）